IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) β-галактозидаза субстратынын аналогу болуп саналат, ал индукциялуулугу жогору.IPTG индукциясы астында индуктор репрессордук протеин менен комплекс түзө алат, Ошентип, репрессордук белоктун конформациясы өзгөрөт, ал максаттуу ген менен айкалыштырылбайт жана максаттуу ген эффективдүү чагылдырылат.Ошентип, эксперимент учурунда IPTG концентрациясын кантип аныктоо керек?Канчалык чоң болсо, ошончолук жакшыбы?
Биринчиден, IPTG индукциясынын принцибин түшүнүп алалы: E. coli лактоза оперону (элементи) тиешелүүлүгүнө жараша β-галактозидазаны, пермеазаны жана ацетилтрансферазаны коддогон үч структуралык генди, Z,Y жана A ды камтыйт.lacZ лактозаны глюкозага жана галактозага, же алло-лактозага гидролиздейт;lacY чөйрөдөгү лактозанын клетка мембранасы аркылуу өтүп, клетканын ичине киришине мүмкүндүк берет;lacA ацетил тобун ацетил-КоАдан β-галактозидге өткөрүп берет, бул уулуу эффектти жоюуну камтыйт.Мындан тышкары, О операциялык ырааттуулугу, P башталгыч ырааттуулугу жана жөнгө салуучу I ген бар. I ген коду оператордук ырааттуулуктун О абалына байланыша алган репрессордук белок болуп саналат, ошондуктан оперон (мета) репрессияланат жана өчүрүлгөн.Ошондой эле P ырааттуулугунун жогору жагында катаболикалык ген активатор протеин-CAP байланышуу сайты бар.Үч ферменттин коддоочу гендери ген продуктуларынын макулдашылган экспрессиясына жетүү үчүн бир эле жөнгө салуучу аймак тарабынан жөнгө салынат.
Лактоза жок болгон учурда лак оперон (мета) репрессия абалында болот.Бул учурда PI промотор ырааттуулугунун көзөмөлүндө I ырааттуулугу менен туюнтулган лак-репрессор О ырааттуулугу менен байланышат, бул РНК полимеразанын Р ырааттуулугу менен байланышына жол бербейт жана транскрипциянын башталышын бөгөттөйт;лактоза болгондо, лак оперон (мета) индукцияланышы мүмкүн Бул оперон (мета) системасында чыныгы индуктор лактозанын өзү эмес.Лактоза клеткага кирип, аллолактозага айлануу үчүн β-галактозидаза тарабынан катализделет.Акыркысы индуктордук молекула катары репрессор белок менен байланышып, белок конформациясын өзгөртөт, бул репрессордук белоктун О ырааттуулугунан жана транскрипциясынан диссоциацияланышына алып келет.Isopropylthiogalaktoside (IPTG) аллолактоза сыяктуу эле таасир этет.Бул абдан күчтүү индуктор, ал бактериялар тарабынан метаболизмге кирбейт жана абдан туруктуу, ошондуктан лабораторияларда кеңири колдонулат.
IPTG оптималдуу концентрациясын кантип аныктоого болот?Мисал катары E. coli алалы.
Оң рекомбинантты pGEX (CGRP/msCT) камтыган E. coli BL21 генетикалык жактан иштелип чыккан штаммы 50μg·mL-1 Amp камтыган LB суюк чөйрөсүнө эмделди жана 37°Cде түнү бою өстүрүлдү.Жогоруда маданият 1:100 катышы боюнча 50μg·mL-1 Amp камтыган 50mL жаңы LB суюк чөйрөсүнө 10 бөтөлкөлөргө эмделген жана OD600 мааниси 0,6 ~ 0,8 болгондо, IPTG акыркы концентрацияга кошулган.Бул 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0ммоль · L-1.Ошол эле температурада жана ошол эле убакта индукциялангандан кийин андан 1 мл бактерия эритмеси алынган жана бактериялык клеткалар центрифугалоо жолу менен чогултулган жана ар кандай IPTG концентрацияларынын белоктун экспрессиясына таасирин талдоо үчүн SDS-PAGEге дуушар болгон, андан кийин эң чоң протеин туюнтмасы менен IPTG концентрациясын тандаңыз.
Эксперименттерден кийин IPTG концентрациясы мүмкүн болушунча чоң эмес экени аныкталат.Себеби IPTG бактерияларга белгилүү бир уулуу касиетке ээ.Концентрациядан ашып кетсе клетка да өлөт;жана жалпысынан айтканда, клеткада эрүүчү протеин канчалык көп болсо, ошончолук жакшы деп үмүттөнөбүз, бирок көп учурларда IPTG концентрациясы өтө жогору болгондо, көп сандагы кошулма пайда болот.Дене, бирок эрүүчү протеиндин көлөмү азайган.Ошондуктан, эң ылайыктуу IPTG концентрациясы көбүнчө канчалык чоң болсо, ошончолук жакшы, бирок концентрация ошончолук төмөн болот.
Гендик-инженердик штаммдарды индукциялоонун жана өстүрүүнүн максаты максаттуу белоктун түшүмүн жогорулатуу жана чыгымдарды азайтуу болуп саналат.Максаттуу гендин экспрессиясына штаммдын өздүк факторлору жана экспрессия плазмидасы гана эмес, ошондой эле индуктордун концентрациясы, индукция температурасы жана индукция убактысы сыяктуу башка тышкы шарттар да таасир этет.Ошондуктан, жалпысынан, белгисиз белокту экспрессиялоодон жана тазалоодон мурун, ылайыктуу шарттарды тандоо жана эң жакшы эксперименттик натыйжаларды алуу үчүн индукция убактысын, температурасын жана IPTG концентрациясын изилдөө эң жакшы.
Посттун убактысы: 31-дек 2021